如何利用悬浮培养技术实现AAV产量和活性的大幅提升？

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2021年8月27日/医麦客新闻 eMedClub News/--基因治疗是指通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展，进而有望从根本上治愈一些现有的常规疗法不能解决的疾病。其中，腺相关病毒（AAV）因其较低的免疫原性和位点特异性整合能力被认为具有更好的安全性，得到了蓬勃发展，已占据超过50%的市场，成为热门中的热门。

此前，信念医药自主研发的BBM-H901注射液（适用于预防血友病B成年男性患者出血的AAV基因治疗药物）获得国家药监局的药物临床试验批准。这是国内第一个获得批准进入注册临床试验的血友病AAV基因治疗药物，也标志着AAV基因治疗药物的时代已经正式来临！

随着临床申请的有序进行，如何进行AAV产业化生产，也成为了AAV治疗药物前进道路上一个不可逾越的门槛。

AAV生产流程概览

AAV的生产工艺非常复杂，根据平台的不同，可分为：

• 质粒转染HEK293细胞平台

• 杆状病毒感染昆虫细胞系平台

其中质粒转染HEK293细胞由于生产简单、临床经验更加成熟而成为大家的首选。

以最为流行的质粒转染HEK293细胞平台为例，整个生产包括2个主要环节：质粒的生产和病毒载体的生产（图1）。其中，质粒生产技术已经较为成熟，而病毒载体的生产则面临着较大的挑战，还存在着大量可提升的空间。

▲ 图1：AAV生产流程概览

AAV病毒载体生产的挑战

在AAV药物产业化阶段，因为给药浓度通常较高，意味着一次治疗所需的病毒载体量也更大，需要更高的成本，这也是为什么基因治疗药物的价格如何昂贵的原因之一。为了提高药物的可及性，进一步降低成本，提高AAV病毒载体的产量和活性成为了大家面临的最严峻的挑战。

传统的AAV病毒载体生产是通过三质粒共转HEK293贴壁细胞株进行生产的（图2），在贴壁细胞培养方式中，细胞只能粘附在几十升的转瓶瓶壁上，如需放大生长，则会受到人力、成本以及厂房空间的限制，很难进行工艺放大。

▲ 图2：三质粒共转HEK293细胞示意图

这些限制驱使着生物制药厂商逐渐从贴壁培养方式转向悬浮培养方式，悬浮培养的优势在于不仅可以实现规模化的生产，且有着更加成熟的自动化的工艺技术，在未来的大规模生产中，必然会替代传统的贴壁培养，成为主流。

如何利用悬浮培养技术提高的产量和活性

目前工业上，悬浮培养系统主要分为两种技术，搅拌式和Wave式，不同于比较容易理解的搅拌式，Wave式以其波浪式的培养方式而闻名（图3），最先由著名科学家先灵宝雅在1996年发明，在后续的发展中，由于其具有更高的细胞活性和细胞产量，在细胞培养中，特别适合种子培养阶段。

▲ 图3：Wave培养模式示意图

而在AAV病毒载体生产阶段，通常包括2个培养阶段：即质粒转染前的培养和转染后的培养，中间的关键点在于转染，即外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，通过质粒将目的基因转入生产细胞中。转染效率将直接决定了病毒载体的产量和活性，因此如何提高转染效率就成为了我们首先专注的重点。

影响转染试验的因素主要有以下几点：

• 转染试剂：高效、低毒、方便、廉价的转染试剂是大家追求的目标

• 转染方法：不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异，确定最佳转染条件需要考虑：

1）细胞培养物：健康的细胞培养物是成功转染的基础，不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。

2）细胞密度：不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。

• 细胞状态：一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。

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在转染试剂和转染方法确认的情况下，最难控制的就是细胞状态。前面我们提到的Wave式培养方式对于细胞更加友善，因此也更加适合在转染前的细胞培养。下面我们详细解析下Wave式培养中的操作细节，期望得以最大程度的保证细胞活性：

1、摇动速度

波浪式反应器的摇动速度取决于培养量体积、细胞密度以及细胞袋生物反应器大小。一般情况下，摇动速度随着需氧量的增加而增加。

➤在2L、10L和20L细胞袋，反应器的摇动速度最初设定为12-20rpm。

➤当培养量体积在最低时（体积占细胞袋的10%-20%），初始转速为12rpm，随着添加物的增加，摇动速度可提高到20-25rpm。

➤当培养量达到细胞袋的最大体积时或细胞密度较高时，速度可达到25rpm。

2、摇动角

在2L、10L和20L细胞袋时，摇动的初始角度为6°，当分别使用2L、10L和20L细胞袋时，相应的细胞袋生物反应器处于工作体积的100%时，为了增加氧气的转移，可能需要7°或8°的摇动角度。

如果出现过大的气泡，则增加摇动角，同时降低速度。经验表明，这将有助于打破泡沫。此外，在监测氧气水平时，根据需要可调整摇动角度。

3、充气速度

细胞培养袋应保持充气状态，在充气过程中，流速可高达0.5L Ipm。在培养的最初阶段，保持充气的密闭性，若观察到细胞太过生长旺盛，可分别将2L、10L和20L细胞袋的充气速度降低，设定为0.1lpm、0.2lpm和0.3lpm。

4、温度

HEK293细胞培养常见的温度控制为36℃~37℃。

5、PH控制

PH控制很关键，由于波式生物反应器系统具有较高的气体传递能力，PH值会迅速漂移。主要使用方式为以下步骤：

① 最初，在细胞袋生物反应器中充进10%的二氧化碳/空气，再将培养基加入生物反应器，关闭空气进出口过滤器。然后以15rpm的速度搅拌1到2小时，使PH值和温度完全平衡。接种前，通过取样检查PH值。

② 接种细胞。关闭出口和入口的过滤器。

③ 监测PH值、葡萄糖浓度和细胞密度。一旦PH值和葡萄糖浓度下降，转变为5%二氧化碳/空气并连续充气到最大空间，这种情况通常在24小时至60小时内发生。一旦细胞生长旺盛，培养基PH就不会上升，而二氧化碳的清除则有助控制PH值。

④ 提高摇动速度和角度以保持稳定。通过使用离线采样、DOOP系统或WAVEPOD控制器来估计氧气的溶解度。

WAVE生物反应器的选择

在Wave式生物反应器的选择上，最负盛名的无疑是Cytiva公司的Wave反应器，由于具有先进的传感器和智能控制策略等功能增强摇摆技术，性能可靠且精确。通过Cytiva官网，我们可以看到有以下几个主要特点：

运动模式更温和

与很多其他波浪式生物反应器只能提供一个匀速运动模式相比，Wave 25新增了新的运动模式调节，不仅可以提供匀速运动模式，还能在摇摆过程中提供如同钟摆式的变速运动模式，从而使得整个细胞培养过程剪切力更低，对细胞更加友善温和，可进一步提高细胞活性。

▲ 图 4. 左边为原有运动模式，右边为新增运动模式

一次性全封闭式系统，无污染

生物反应器的封闭性系统和一次性使用技术，显著减少污染的几率。密闭的一次性细胞袋是由USP VI级塑料制成，通常用于生物液体处理，细胞仅接触培养袋内壁。这种一次性细胞袋具有完整的入口、出口过滤器以及填充的配件，这些细胞袋使用后经过伽马灭菌并丢弃。整个过程中，有效避免了交叉污染、清洁消毒和其他验证程序。

智能精确的过程控制

系统配备用于温度、 流体处理、 pH 值和溶解氧 (DO) 的先进传感器和自动控制器。可动态监测各项系统动力学特征，用于创建针对不同培养量定制的预定义参数库控制，自动确定适合运行的参数，该功能有助于快速启动并实现精确、稳定的控制。

操作灵活， 可以采用单一或双重培养模式

可以同时运行单一或双重培养，实现精准控制。使用双重培养模式时， 可使用相同或不同的袋尺寸和/或工作容积来进行双重培养，独立控制温度、 pH 值和 DO 等参数。独立的泵装置也可以控制流体的添加和/或去除，实现在两种平行的培养物中实现量身定制的进料策略、 培植基添加或灌注等操作。

▲ 图 5. ReadyToProcess WAVE 25 生物反应器系统可以使用双重培养模式。

总结

近年来，基因治疗技术的领域越来越繁荣，AAV作为天生的递送工具，在基因治疗领域中应用广泛，是成就了多款治疗疾病的基因疗法。此外，由于基因治疗技术在快速的发展下，越来越多的基因治疗候选药物进入后期的开发阶段，进而生物反应器的对产能及生物原料的获取越来越重要。从贴壁式细胞培养到悬浮培养的工艺转化，这一转化不仅仅是生产上的转化，使得企业对基因治疗的质控也更加有益。

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课程题目：HEK293 悬浮/贴壁 ADCF可放大工艺优化及案例分享

课程介绍：

1.对HEK 293构建 ADCF 生产平台目的及供应商管理 

2.HEK 293 细胞株改造方向及案例分享

3.HEK 293 ADCF 生产材料的优化及案例分享

4.HEK 293 批次培养及灌流工艺案例分享